SEP SNEST DGEST
INSTITUTO
TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.
PRÁCTICA NO.3.
“PREPARACIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVO”
QUE PRESENTAN:
FLOR DEL CARMEN DORANTES NAVA
ZULAI ESPINOZA AVIANEDA
LUIS ANTONIO FLORES HERNÁNDEZ
FANNY IMELDA PASTENES FELIZOLA
LUZ EUGENIA RUÍZ NAGERA
DEYANIRA VERGARA PÉREZ
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
CIUDAD ALTAMIRANO, GRO. MÉXICO. 07 DE MARZO DEL 2012
PREPARACIÓN
DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN
El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología
del instituto tecnológico de Cd. Altamirano, teniendo como objetivo conocer la forma de preparación de los medios de Murasshine y
Skoog y B5 (o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales. Posteriormente se prosiguió a pesar las Sales, sacarosa y phytagel en la balanza analítica,
consecutivamente se agregó a un vaso de precipitado con un volumen de 500 ml las 6 soluciones previamente preparadas; posteriormente se
agregó la sacarosa disolviendo hasta formar una solución homogénea,
seguidamente se aforó la solución en una probeta de 350ml; inmediatamente se ajustó el pH para
posteriormente disolver el phytagel
calentando el medio en una parrilla, para después distribuir el medio en 9
recipientes de cultivo y finalmente se sellaron los recipientes con el medio
estéril hasta su uso.
Palabras claves: Medios de Murasshine y Skoo,
reactivos, sales,
phytagel, balanza analítica, cultivo de tejidos vegetales.
ABSTRACT
The present work was carried
out in the microbiology laboratory of the Technological Institute of Ciudad
Altamirano, with the objetivo conocer the way of preparing and Skoog media
Murasshine and B5 (Gamborg or) for plant tissue culture. Subsequently continued
despite Salts, sucrose and phytagel en analytical balance, consecutively
agregó a beaker with a volume of 500 ml
of 6 solutions previously prepared and thereafter dissolving sucrose was added
to form a homogeneous solution, successively gauged the solution in a 350ml
beaker and immediately the pH was adjusted to dissolve the Phytagel
subsequently heating the medium in a grid, and then distributing the medium in
culture vessels 9 and finally sealed containers with the sterile environment
until use.
Keywords: Murasshine and Skoo Media, reagents, salts, Phytagel, analytical balance, plant tissue.
I.
ANTECEDENTES
Las primeras experiencias relacionadas con
el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se
logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas
de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron
a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas
del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales
debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y
desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de
microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios
estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas
dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas
se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado,
haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de
nutrientes en un recipiente estéril.
Actualmente se ha convertido en una
herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de
enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes
plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Los medios de cultivo son la base para el
crecimiento de tejidos vegetales, estos deben tener los requerimientos orgánicos,
inorgánicos y condiciones o parámetros óptimos, por esta razón es de suma
importancia que se realicen de una manera adecuada, atendiendo a los criterios
establecidos, sin dejar a lado las condiciones asépticas para su elaboración,
de ahí el éxito o fracaso del desarrollo de la planta.
III. OBJETIVO
Conocer la
forma de preparación de los medios de Murasshine y Skoog, B5 (Gamborg) para el
cultivo de tejidos vegetales.
IV. JUSTIFICACIÓN
Las plantas requieren de ciertos nutrientes para poder
desarrollarse y crecer, es por ello que es de gran importancia conocer cuáles
son estos nutrientes que requiere, así como el saber cómo es que se preparan estos medios de
cultivos. Como biólogos se debe tener conocimiento de estos datos para poder
propagar plantas de buena calidad y en condiciones favorables y así presentar
al público plantas de buena calidad.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo in vitro consiste en
tomar una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por ej.
el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión,
nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril
(usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas,
(Muñoz M. 2006)
La
propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos
de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas,
embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son
realizados por personal especializado en medios específicos (hormonas,
minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y
condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz). Una vez
ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible
automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción,
(Barceló et al. 1980)
Es esencial mantener la esterilidad del
medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier
microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una
velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán
y matarán a los tejidos, (Pierik, R.L.M. 1987)
Con el propósito
de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se
multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse además
ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye
o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso
solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido, (Barthelemy R, et al. 1977)
Los cultivos
necesitan de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son
esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas,
azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales que se
conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos
compuestos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y
esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o
en uno separado
La formulación del medio cambia según se
quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u
obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales, ver tabla 1.
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Preparación de medios de cultivos (MS)
Se tomó un vaso de precipitados con 100 ml. De agua destilada al
cual se le agrego las 6 soluciones antes preparadas haciendo uso de una pipeta,
las soluciones fueron agregadas de una manera ordenada para no repetir la misa
solución. El orden se colocó de la siguiente manera:
1.- Nitratos
2.- Sulfatos
3.- Quelatos
4.-PoBoMo
5.- Alógenos
6.- Orgánicos
Al tener mezcladas todas las soluciones en el vaso de
precipitados, se agregó 10.5g de sacarosa, ésta tiene que estar bien disuelta,
por tal motivo se tuvo en constante
movimiento hasta tener una solución homogénea.
Teniendo ya una solución homogénea se vació a una probeta
graduada y aforaró a 350 ml. Se tiene que tomar muy en cuenta no pasarse del
volumen ya mencionado, puesto que no se tendría los resultados requeridos.
6.2 Medición del pH
Para poder medir el pH se vació la solución nuevamente a un vaso
de precipitados, se midió el pH con un potenciómetro. Si se obtiene un pH bajo
se le aplica 0.1N o bien 0.01N (por gotas) de NaOH para subir el pH. Por el
contrario si el pH es elevado se le aplica 0.1 N o bien 0.01 N de HCL para
bajar el pH. El rango que se tiene para el pH adecuado es de 5.7 a 6.0).
6.3 vaciado de Phytagel
Al tener la solución con el pH adecuado se colocó en una
parrilla eléctrica. Cuando la solución alcanzó una temperatura de 50 a 70 °C se
vació poco a poco 1.05 de phytagel y se agitó constantemente para poder tener
una solución homogénea, además para que el phytagel no se engrumara. Una vez
que la solución tenia toos los componentes necesarios y requeridos, se dejó
bullir por dos minutos. Transcurrido el tiempo, la solución del cultivo, se
dejó a ambiente para posteriormente vaciar 25ml aproximadamente en 15 frascos
con tapa rosca. Posteriormente se dejó enfriar la solución en los frascos, para
poder sellarlos. Al tener los frascos serrados y sellados se metieron al congelador
de un refrigerador.
VII. RESULTADOS
Lo primero que se realizo fue poner en forma ordenada todas las
soluciones que se utilizarían para preparar el medio de cultivo Murasshine y
Skoog en la mesa del laboratorio con una pipeta exclusiva para cada
solución. El orden fue el siguiente:
·
* Nitratos
·
* Sulfatos
·
* Quelatos
·
* Solución de Po Bo Mo
·
* Halógenos
·
* Orgánicos
Para iniciar, se tomó 3.5ml
de cada una de las soluciones stock antes preparadas, haciendo uso de una
pipeta para cada solución.
Cabe señalar que una gran
ventaja es que todas las soluciones estaban a una concentración de 100X lo que
facilito el cálculo para agregarlo a nuestro medio de cultivo.
Por otro lado se pesó 10.5g
de sacarosa y 1.05g de phytagel en una balanza analítica, haciendo uso de papel
aluminio para su pesado exacto y preciso. Una vez que el vaso de precipitado contenía
las 6 soluciones stock, se prosiguió a disolver la cantidad de sacarosa.
Se disolvió la sacarosa en
100 ml de agua en un vaso de precipitado con las 6 soluciones stock.
Después de esto se diluyeron
bien todas las soluciones agregadas junto con la sacarosa y se afora a 350ml en
una probeta con agua de garrafón, debido a la falta de agua destilada como tal.
Cuando se ha realizado el
aforado la solución se vuelve a verter en el vaso de precipitado para medir el
pH con el potenciómetro.
Para subir el pH se agregó NaOH gota a gota hasta
llegar al pH deseado que era de un rango de 5.7 a 6.0.
Después de haber obtenido el pH deseado se
calienta la solución a 50-70°C y se agrega el Phytagel poco a poco hasta que se
haya diluido completamente, cunado la solución empiece a hervir se deja 1 o 2
minutos y después se apaga.
Se agrega la solución en los
frascos previamente marcados para identificarlos. Se agregan aproximadamente
25ml a cada uno de los frascos con ayuda de un frasco modelo lleno de agua para
tomar la medida aproximada de 25ml para llenar los otros frascos con la
solución.
Por último se sellaron los frascos y se
guardaron en el refrigerador.
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1 Conclusiones
Se logró preparar 350 ml de medio
M. S partiendo de soluciones stock de sales y orgánicos con una concentración de 100X exitosamente, añadiendo
30 g/l de sacarosa, 3 g/l de phytagel. Una vez que se obtuvo el medio M.S con
la concentración correspondiente de cada uno de los ingredientes, se tuvo un
pequeño inconveniente con respecto al ajuste de pH ya que este estuvo por
debajo del rango adecuado, pero posteriormente se le agrego NaOH para ajustar
el pH al rango adecuado una vez que se logró ajustar el pH se aforo en una
probeta de 350 ml para posteriormente ser nuevamente vertido al vaso de
precipitado y poder agregarle el phytagel y agitarlo, con una temperatura
de 50-70 ° c una vez que se enfrió un poco se vertió en
cada uno de los frascos previamente esterilizados, para ser introducidos en
refrigerador y poder usarlos en la siembra de vegetales.
Con esta práctica se logró que el alumno aprendiera
a preparar medios para el cultivo de vegetales, así como la importancia que
tienen cada uno de los componentes en el medio de cultivo y lo que ocasiona si
nuestra solución no está concentrada en los parámetros establecidos para el
cultivo de tejidos vegetales, esto es de suma importancia ya que de esto va a
depender si nuestro tejido vegetal se desarrolle en nuestro medio in vitro de
forma viable.
8.2 Recomendaciones
Se recomienda que se pesen adecuadamente cada uno de los ingredientes
que contendrá el medio de cultivo ya que
un error cambia en gran medida la concentración de nuestra solución, así
también se recomienda a los alumnos llevar acabo todos pasos necesarios y
revisar el formato de la práctica, pedir ayuda al profesor en caso de tener
alguna duda en alguno de los pasos que se especifican en la práctica, es
importante que cuando se le agrege el phytagel se esté agite constantemente
para evitar que se forme algún grumo que pueda dañar nuestra solución o medio
de cultivo esto es en caso de que en el laboratorio no se cuente con
suficientes pastillas magnéticas y con el material necesario.
IX. FUENTES
CONSULTADAS
Barceló et al. (1980) Fisiología vegetal. Editorial
Pirámide Barthelemy R, Dawson J, Lee A (1977) Técnicas para
el laboratorio de biología. Compañía Editorial Continental Muñoz de Malajovich, M. A. (2006) Biotecnología. Editorial
Universidad Nacional de Quilmes Pierik, R.L.M.
(1987) In vitro culture of higher plants. Editorial Martinus Nijhoff Publishers
ANEXOS
1. ¿Qué es un medio de cultivo?
R= formulación químicamente definida, donde los explantes
(plantas) encuentran las condiciones para desarrollar su potencial intrínseco.
2. ¿Cuáles son los compuestos orgánicos para los medios de cultivo?
ü Carbohidratos
ü Vitaminas
ü Aminoácidos
ü Reguladores de crecimiento.
3. ¿Cuáles son los componentes inorgánicos necesarios para los
medios de cultivo?
ü Macroelemnetos(N,P,K,A,Mg,S)
ü Microelementos (Fe,SoZn,Ni,B, Al,Mn, Mo, Cu,I)
4. ¿Por qué consideras importante los medios de cultivo?
R= porque sirven para propagar tejidos vegetales, en el
laboratorio de biotecnología
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