PRACTICA 4

SEP                                   SNEST                                  DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.

  

PRÁCTICA No.4.

SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

QUE PRESENTAN:

Flor del Carmen Dorantes Nava

Zulai Espinoza Avianeda

Luis Antonio Flores Hernández

Fanny Imelda Pastenes Felizola

Luz Eugenia Ruíz Nagera 

Deyanira Vergara Pérez

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Ciudad Altamirano, Gro. México. 23 de  Marzo del 2012

“SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)”

¹Dorantes N.F.C., ¹Espinoza A.Z., ¹Flores H.L.A., ¹Pastenes F. F. I.  ¹ Vergara P.D. ¹Ruiz N.L.E

¹Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano

RESUMEN

     El cultivo de tejido vegetal se ha convertido en una herramienta importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales. Por esta razón la presente practica tuvo como objetivo sembrar explantes de Manihot esculenta con el fin de aprender como sembrar los tejido vegetal y hacer buen uso del mismo dentro de la campana de flujo. Primero se tiene que esterilizar la campana con alcohol al 70%, posteriormente introducir el todo el material que se utilizara después de esto esterilizar los explantes, cortarlos y sembrarlos en el medio de cultivo. Todo esto son una absoluta limpieza y orden durante toda la práctica. Se obtuvo un porcentaje de contaminación de un 0% y un 100% de sobrevivencia, esto gracias al trabajo del equipo y por la absoluta asepsia que hubo al momento de sembrar los explantes, uno de los factores mas importantes para sembrar tejido vegetal in vitro es la asepsia con la que se realiza la siembra ya que esta determina el grado de contaminación del tejido vegetal ya cultivado. La práctica tuvo éxito ya que se consiguió un porcentaje de contaminación del 0% así como se aprendió a manejar el tejido vegetal dentro de la campana de flujo.

ABSTRACT

     The plant tissue culture has become an important tool in the selection, breeding, disease control and mass production of cash crops and involves different plants in agriculture, horticulture, forestry and orchards. For this reason this practice was aimed at sowing Manihot esculenta explants in order to learn how to grow the plant tissue and make good use of it within the flow hood. First have to sterilize the hood with 70% alcohol, then introducing the material to be used thereafter sterilized explants, cutting and planting them in the culture medium. This is an absolute cleanliness and order throughout the practice. We obtained a contamination rate of 0% and 100% survival, this thanks to the team and the absolute asepsis that was planted when the explants, one of the most important factors to grow in vitro plant tissue is asepsis with the planting is done because this determines the degree of contamination of plant tissue and cultured. The practice was successful as was achieved contamination percentage of 0% and is learned to operate the plant tissue within the flow hood.

Keywords: plant tissue explant asepsis, flow hood, contamination.

I ANTECEDENTES

     De acuerdo a Fossard los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas. Por otro lado el tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Los explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo (Fossard 1999)

      Otros explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).

     Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo (Kyte & Kleyn 1996).

     Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte. Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de unas semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999).

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

     En la actualidad existen varios problemas en los diferentes cultivos de plantas (plagas de insectos, hongos, bacterias, et.). Para una mejor producción se requiere de condiciones específicas para su optimo desarrollo, es por ello que es necesario realizar los cultivos in vitro.

III. OBJETIVOS 

·         Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo

·         Asimilar las habilidades en la siembra del material vegetal.

IV. JUSTIFICACIÓN

      Los cultivos in vitro son la mejor opción para el cultivo de plantas puesto que tiene los requerimientos necesarios para su optimo desarrollo. Además la clave para el mejor desarrollo de esta es el buen manejo de siembra ya que es por el buen manejo que se los tienen resultados que se pretenden optener.

V. Fundamento teórico    

     Las plantaciones forestales tienen una función creciente en el abastecimiento futuro de la industria forestal mundial y liberan presión sobre el uso maderero de los bosques naturales. Al respecto, Sedjo (1997) destacó el aporte de las innovaciones en genética y biotecnología para obtener árboles de buen crecimiento y con características deseadas. Sin embargo, la concentración de la producción industrial en plantaciones forestales con unas pocas especies plantea el desafío de la diversificación con nuevas especies para asegurar una producción forestal sostenible.

     Entre las especies con potencialidad de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad y uso de la madera está el raulí, Nothofagus alpina (Nothofagus procera (Poepp. et Endl.) Árbol endémico de los bosques subantárticos de Chile y Argentina, crece en las laderas de las montañas, a altitudes intermedias entre 300–1 200 m, en suelos profundos con buen drenaje (Hoffmann, 1982). Sin embargo, los niveles de producción de semillas tienen fluctuaciones anuales que corresponden a patrones cíclicos de variación en la especie (Gutiérrez, 2000; Ipinza y Espejo, 2000). Para aumentar la productividad del recurso y obtener un beneficio sostenible, se enfatiza la aplicación de herramientas de mejoramiento genético junto con técnicas biotecnológicas y silvícolas en la propagación de esta especie. Las estrategias de mejoramiento de especies forestales incorporan técnicas de propagación asexual como la macropropagación (mediante injerto y estaca) y la micropropagación que permiten transferir toda la varianza genética a los descendientes, duplicando la ganancia genética asociada a los esquemas sexuales de propagación (Ikemori et al., 1994).

      En especies de Nothofagus la organogénesis directa se inicia con trozos de tejidos, yemas, secciones nodales y axilares obtenidos de plantas juveniles y adultas y se ha definido el estadio óptimo de los brotes y yemas a propagar la embriogénesis somática utiliza semillas como explante inicial (Castellanos et al., 2005). En el cultivo de estos tejidos se emplean los medios nutritivos Broadleaved Tree Medium (BTM), Murashige y Skoog (MS), modificado en las concentraciones de los macronutrientes, y Woody Plant Medium (WPM) con bajas concentraciones salinas, aminoácidos, reguladores de crecimiento y vitaminas. El enraizamiento se ha realizado con éxito en oscuridad, distintos tipos y concentraciones de auxinas y aclimatación gradual en invernadero. Sin embargo, los estudios anteriores no han considerado un número suficiente de árboles que permita evaluar el comportamiento de distintos fenotipos en un proceso de producción a escala comercial de manera continua. 

     El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina.

     No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.

     Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek en 1941 observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

VI. Materiales y métodos.

     La práctica se realizo en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Ciudad Altamirano. 

6.1 Desinfección de la campana de flujo

      Se encendió la campana de flujo 10 minutos antes de empezar a trabajar se desinfectó con alcohol al 70% con papel higiénico se deja secar bien para empezar a trabajar.

 6.2 Introducción del material

      Se introdujo el material con el que va a trabajar dentro de la campana de flujo, los frascos con el medio de cultivo se colocan a un castado, mientras que el mechero y el frasco donde se colocó las pinzas y los bisturís estériles, se ponen en el centro de la campana de flujo, las cajas de petri se colocó a un costado, procurando con esto introducir los materiales por una esquina de la campana de flujo. Uno de los aspectos mas importantes es la desinfección del personal que siembra los explantes ya que la persona encargada de sembrar los explantes debe de lavarse las manos con alcohol al 70%. Esto debe hacerlo cada vez que saque las manos de la campana de flujo también debe procurar hablar poco y no meter la cabeza dentro de la campana.

6.3 Desinfestación de los explantes

      Se prepara cloralex a un 25% aproximadamente para desinfestar los explantes. Se colocó 3 partes de agua estéril en un vaso agregando una cuarta parte de cloralex. Con ayuda de una pinza estéril se colocan los explantes dentro del frasco preparado con cloralex, se deja por 5 minutos y se agita esporádicamente. Después se retiró el cloralex y se colocó en un vaso de precipitado de 500ml, se realiza un segundo lavado durante1 minuto con agua estéril. Después de esto se realizó un tercer lavado con agua estéril durante 5 minutos y se agita esporádicamente el agua que se le va retirando de cada lavado se va colocando en el vaso de precipitado, una ves terminado el lavado se retira el vaso de precipitado de la cámara de flujo junto con los frascos que se utilizaron.

6.4 Corte de los explantes

     Una vez desinfestado los explantes se sacó del frasco y se colocó dentro de caja de petri cuidando de no tocar la parte interna de la caja de petri con los dedos. Con ayuda de unas pinzas y un bisturí previamente esterilizados en fuego directo con ayuda del mechero. Se cortó las partes dañadas por el proceso de desinfestación teniendo cuidado de no cortar las yemas así también se cortan en partes pequeñas de 1 a 2cm aproximadamente para sembrarlos en el medio de cultivo.

6.5 Siembra del explante

     En este proceso se toma un frasco con medio de cultivo se quita el sello, tomar con una pinza (previamente esterilizada) el explante y se coloca dentro del medio de cultivo, esto cuidando que la yema quede hacia arriba, así también es importante hacer esto cerca del fuego y no introducir la mano dentro del frasco con el medio de cultivo, es también de mucha importancia no colocar la tapa boca abajo ni tocar la parte interior de la misma. Una vez sembrado el explante se cierra fuertemente el frasco y de esterilizan de nuevo las pinzas para realizar el mismo procedimiento al sembrar el siguiente explante.

6.6 sellado de los frascos

     Una vez sembrado todos los explantes se realiza el sellado de los frascos, primero se cierra fuertemente con la tapa para después sellarlos con Parafilm y se colocaron en el estante a la luz del sol a una temperatura ambiente.

6.7 Lavado del material

     Una vez concluida la práctica se realizó el lavado del material que se utilizo así también se apagó la campana de flujo. 

VII. Resultados

     La práctica se realizó atendiendo todas las medidas asépticas necesarias, el material utilizado, fue esterilizado previamente; cada una de las actividades se realizaron dentro de la campana de flujo laminar para evitar cualquier contaminación por microorganismos (hongos, bacterias). La campana fue previamente desinfectada con alcohol y colocó dentro de ella un mechero encendido.

     El compañero que realizó la siembra del material vegetal, se desinfectó previamente con jabón y alcohol al 70%, figura 1. El cloro utilizado se preparó dentro de la cámara de flujo laminar,  se tomó un frasco con 2/3 de agua estéril y agregó 1/3 de cloro, figura 2.

   Una vez que se había preparado el cloro, se prosiguió a la desinfección del material vegetal, se tomó cada uno de los explantes y se introdujeron al frasco que contenía el cloro, dejando éstos por 5 minutos, agitándolo en ocasiones; cuando transcurrió el tiempo, se prosiguió a retirar el cloro de los explantes para realizar el primer lavado con agua estéril durante 1 minuto; cuando pasó el tiempo, se retiró el agua y realizó el segundo lavado nuevamente con agua destilada pero ahora por 5 minutos, por  último se retiró el agua estéril, figura 3.

Fig 3: Desinfección del material vegetal.

     Con los explantes desinfestados, se prosiguió a realizar el corte de las partes que quedaron quemadas por el cloro. Se tomó el primer explante con una pinza y se colocó en una caja de Petri para realizar el corte con un bisturí, para realizar el corte del segundo explante, se tomó la pinza y el bisturí e introdujeron a un frasco con alcohol, posteriormente fueron flameadas en el mechero y así realzó el segundo corte; para realizar los siguientes cortes, las herramientas fueron esterilizadas en alcohol y flameadas en el mechero. Cada uno de los explantes ya cortados fueron colocados en la caja de Petri para realizar la siembra en el medio de cultivo, figura 4.

Fig 4: Corte de los explantes

     Para realizar la siembra de los explantes, cada uno de ellos se tomó con una pinza estéril y fueron introducidos a los frascos con medio de cultivo, estos se colocaron con la yema hacia arriba; cabe mencionar que para cada siembra la pinza fue esterilizada con alcohol y flameada con el mechero; cada frasco con el explante fue sellado y colocado en el área de incubación, figura 5.

Fig 5: Siembra del material vegetal:

     En un máximo de 72 horas se observan los resultados obtenidos en la práctica, como material vegetal que está creciendo, contaminado o muerto. Los resultados obtenidos fueron:

 

 

VIII. Conclusiones y recomendaciones

     En la práctica se obtuvo un 0% de contaminación en los medios de cultivos; esto lo redituamos a que la siembra del material vegetal se realizó atendiendo a todas las medidas asépticas necesarias, ésta se realizó en la campana de flujo laminar del laboratorio de usos múltiples; aunado a ello, el compañero que realizó la siembra lo hizo de una manera adecuada, siempre desinfectando las manos cuando estas salían de la campana de flujo laminar, el material utilizado como las herramientas fueron correctamente esterilizadas así como el material vegetal desinfestado.

      También se debe el éxito de la práctica a la buena explicación dada por el profesor encargado Francisco Puche  Acosta, pues de no haber dado una excelente explicación, la práctica hubiese sido un fracaso.

     Es importante que la siembra del material vegetal se realice tomando todas las medidas asépticas necesarias, pues de esto depende el éxito o fracaso del crecimiento y desarrollo del material vegetal.

IX. Bibliografía

ü  * Sedjo, R.A. 1997. El sector forestal: innovaciones importantes. Documento de debate 97-42. Recursos para el Futuro, Washington

ü  * Poepp. Et al,. Embriogénesis somática como alternativa potencial para la regeneración in vitro del género Nothofagus. UACH. 59–74p.

ü  * Hoffmann, A. 1982. Flora Silvestre de Chile. Zona Austral. Fundación Claudio Gay. Santiago, Chile. Editorial Lord Cochrane. P: 258

ü  * Gutiérrez, B. 2000. Áreas productoras de semillas en el mejoramiento genético Instituto Forestal. P: 215–235.

* * Ipinza, R., y J. Espejo. 2000. Biología Reproductiva en Nothofagus. Domesticación y Mejora Genética de Raulí y Roble. Universidad Austral de Chile/Instituto.  Forestal. P: 75–93.

ü  * Ikemori, Et al. 1994. Integrating biotechnology into Eucalyptus breeding. Tokio, Japan. P: 77–84.

ü  * Castellanos et al., 2005. In vitro propagation of Nothofagus P: 58.

ü  *Caplin y Steward 1948, 1952.

Anexos

1) Que son los explantes:

R=  Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas.

2) Menciona algunos  explantes y que crees que se podría micropopagar con los mismos:

   Meristemos apicales y las yemas axilares (genéticamente muy estables), sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo.

   Yemas adventicias (genéticamente inestables) producen un alto grado de variabilidad en los clones, no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.

3) Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado. ¿Para qué?

R= para evitar la proliferación de contaminantes biológicos tales como bacterias, hongos y levaduras principalmente en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y por ende  compiten con él mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo.

4) A donde son transladados los explantes desinfectados:

R= son trasladados a una cámara de flujo laminar la cual proporciona aire filtrado, libre de microorganismos.

5) Que es lo que se lleva a cabo en la cámara de flujo laminar y en la cámara de crecimiento que condiciones encontramos para un explante:

R= se lleva a cabo la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el frasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

6) Después de algunas semanas a donde se traslada el cultivo ya que este ha desarrollado algunas raíces y hojas:

R= se realiza el traspaso al invernadero.