SEP SNEST DGEST
INSTITUTO
TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.
PRÁCTICA No.4.
SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
QUE PRESENTAN:
Flor del Carmen Dorantes Nava
Zulai Espinoza Avianeda
Luis Antonio Flores Hernández
Fanny Imelda Pastenes Felizola
Luz Eugenia Ruíz Nagera
Deyanira Vergara Pérez
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
Ciudad Altamirano, Gro. México. 23 de
Marzo del 2012
“SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)”
1Dorantes N.F.C., 1Espinoza
A.Z., 1Flores H.L.A., 1Pastenes F. F. I. 1 Vergara P.D. 1Ruiz
N.L.E
1Instituto
Tecnológico de Cd. Altamirano
RESUMEN
El cultivo de tejido
vegetal se ha convertido en una herramienta importante en la selección,
cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de
cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales
y frutales. Por esta razón la presente practica tuvo como objetivo sembrar explantes
de Manihot
esculenta con el fin de aprender como sembrar los tejido
vegetal y hacer buen uso del mismo dentro de la campana de flujo. Primero se
tiene que esterilizar la campana con alcohol al 70%, posteriormente introducir
el todo el material que se utilizara después de esto esterilizar los explantes,
cortarlos y sembrarlos en el medio de cultivo. Todo esto son una absoluta
limpieza y orden durante toda la práctica. Se obtuvo un porcentaje de
contaminación de un 0% y un 100% de sobrevivencia, esto gracias al trabajo del
equipo y por la absoluta asepsia que hubo al momento de sembrar los explantes,
uno de los factores mas importantes para sembrar tejido vegetal in vitro es la
asepsia con la que se realiza la siembra ya que esta determina el grado de
contaminación del tejido vegetal ya cultivado. La práctica tuvo éxito ya que se
consiguió un porcentaje de contaminación del 0% así como se aprendió a manejar
el tejido vegetal dentro de la campana de flujo.
ABSTRACT
The plant tissue culture has
become an important tool in the selection, breeding, disease control and mass
production of cash crops and involves different plants in agriculture,
horticulture, forestry and orchards. For this reason this practice was aimed at
sowing Manihot esculenta explants in
order to learn how to grow the plant tissue and make good use of it within the
flow hood. First have to sterilize the hood with 70% alcohol, then introducing
the material to be used thereafter sterilized explants, cutting and planting
them in the culture medium. This is an absolute cleanliness and order
throughout the practice. We obtained a contamination rate of 0% and 100%
survival, this thanks to the team and the absolute asepsis that was planted
when the explants, one of the most important factors to grow in vitro plant
tissue is asepsis with the planting is done because this determines the degree
of contamination of plant tissue and cultured. The practice was successful as
was achieved contamination percentage of 0% and is learned to operate the plant
tissue within the flow hood.
Keywords: plant tissue
explant asepsis, flow hood, contamination.
I ANTECEDENTES
De acuerdo a Fossard los
explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células
sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas. Por otro lado el
tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la
especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Los
explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente
muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de
una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el
cultivo (Fossard 1999)
Otros explantes como las yemas adventicias son
más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en
los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con
una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el
fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible
obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo (Kyte & Kleyn 1996).
Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte. Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de unas semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999).
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En la actualidad
existen varios problemas en los diferentes cultivos de plantas (plagas de
insectos, hongos, bacterias, et.). Para una mejor producción se requiere de
condiciones específicas para su optimo desarrollo, es por ello que es necesario
realizar los cultivos in vitro.
III.
OBJETIVOS
·
Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo
·
Asimilar las habilidades en la siembra del material vegetal.
IV. JUSTIFICACIÓN
Los cultivos in
vitro son la mejor opción para el cultivo de plantas puesto que tiene los
requerimientos necesarios para su optimo desarrollo. Además la clave para el
mejor desarrollo de esta es el buen manejo de siembra ya que es por el buen
manejo que se los tienen resultados que se pretenden optener.
V. Fundamento teórico
Las plantaciones forestales
tienen una función creciente en el abastecimiento futuro de la industria
forestal mundial y liberan presión sobre el uso maderero de los bosques
naturales. Al respecto, Sedjo (1997) destacó el aporte de las innovaciones en
genética y biotecnología para obtener árboles de buen crecimiento y con
características deseadas. Sin embargo, la concentración de la producción
industrial en plantaciones forestales con unas pocas especies plantea el
desafío de la diversificación con nuevas especies para asegurar una producción
forestal sostenible.
Entre las especies con
potencialidad de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad y uso de la
madera está el raulí, Nothofagus alpina (Nothofagus procera (Poepp. et
Endl.) Árbol endémico de los bosques subantárticos de Chile y Argentina, crece
en las laderas de las montañas, a altitudes intermedias entre 300–1 200 m, en
suelos profundos con buen drenaje (Hoffmann, 1982). Sin embargo, los niveles de
producción de semillas tienen fluctuaciones anuales que corresponden a patrones
cíclicos de variación en la especie (Gutiérrez, 2000; Ipinza y Espejo, 2000).
Para aumentar la productividad del recurso y obtener un beneficio sostenible,
se enfatiza la aplicación de herramientas de mejoramiento genético junto con
técnicas biotecnológicas y silvícolas en la propagación de esta especie. Las
estrategias de mejoramiento de especies forestales incorporan técnicas de
propagación asexual como la macropropagación (mediante injerto y estaca) y la
micropropagación que permiten transferir toda la varianza genética a los
descendientes, duplicando la ganancia genética asociada a los esquemas sexuales
de propagación (Ikemori et al., 1994).
En especies de Nothofagus
la organogénesis directa se inicia con trozos de tejidos, yemas, secciones
nodales y axilares obtenidos de plantas juveniles y adultas y se ha definido el
estadio óptimo de los brotes y yemas a propagar la embriogénesis somática
utiliza semillas como explante inicial (Castellanos et al., 2005). En el
cultivo de estos tejidos se emplean los medios nutritivos Broadleaved Tree
Medium (BTM), Murashige y Skoog (MS), modificado en las concentraciones de los
macronutrientes, y Woody Plant Medium (WPM) con bajas concentraciones salinas,
aminoácidos, reguladores de crecimiento y vitaminas. El enraizamiento se ha
realizado con éxito en oscuridad, distintos tipos y concentraciones de auxinas
y aclimatación gradual en invernadero. Sin embargo, los estudios anteriores no
han considerado un número suficiente de árboles que permita evaluar el
comportamiento de distintos fenotipos en un proceso de producción a escala
comercial de manera continua.
El primero en
cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar
ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y
levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del
grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina.
No es sino hasta 1934
cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en tejidos cambiales
provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en
tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi
simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a
partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho
significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.
Un factor importante
en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el
descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek en 1941 observa el
efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división
celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D,
tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa
(Caplin y Steward 1948, 1952).
VI. Materiales y métodos.
La
práctica se realizo en el laboratorio de microbiología del Instituto
Tecnológico de Ciudad Altamirano.
6.1 Desinfección de la campana de flujo
Se
encendió la campana de flujo 10 minutos antes de empezar a trabajar se
desinfectó con alcohol al 70% con papel higiénico se deja secar bien para
empezar a trabajar.
6.2
Introducción del material
Se
introdujo el material con el que va a trabajar dentro de la campana de flujo,
los frascos con el medio de cultivo se colocan a un castado, mientras que el
mechero y el frasco donde se colocó las pinzas y los bisturís estériles, se
ponen en el centro de la campana de flujo, las cajas de petri se colocó a un
costado, procurando con esto introducir los materiales por una esquina de la
campana de flujo. Uno de los aspectos mas importantes es la desinfección del
personal que siembra los explantes ya que la persona encargada de sembrar los
explantes debe de lavarse las manos con alcohol al 70%. Esto debe hacerlo cada
vez que saque las manos de la campana de flujo también debe procurar hablar
poco y no meter la cabeza dentro de la campana.
6.3 Desinfestación de los explantes
Se
prepara cloralex a un 25% aproximadamente para desinfestar los explantes. Se
colocó 3 partes de agua estéril en un vaso agregando una cuarta parte de
cloralex. Con ayuda de una pinza estéril se colocan los explantes dentro del
frasco preparado con cloralex, se deja por 5 minutos y se agita
esporádicamente. Después se retiró el cloralex y se colocó en un vaso de
precipitado de 500ml, se realiza un segundo lavado durante1 minuto con agua
estéril. Después de esto se realizó un tercer lavado con agua estéril durante 5
minutos y se agita esporádicamente el agua que se le va retirando de cada
lavado se va colocando en el vaso de precipitado, una ves terminado el lavado
se retira el vaso de precipitado de la cámara de flujo junto con los frascos
que se utilizaron.
6.4 Corte de los explantes
Una vez
desinfestado los explantes se sacó del frasco y se colocó dentro de caja de
petri cuidando de no tocar la parte interna de la caja de petri con los dedos.
Con ayuda de unas pinzas y un bisturí previamente esterilizados en fuego directo
con ayuda del mechero. Se cortó las partes dañadas por el proceso de
desinfestación teniendo cuidado de no cortar las yemas así también se cortan en
partes pequeñas de 1 a 2cm aproximadamente para sembrarlos en el medio de
cultivo.
6.5 Siembra del explante
En este
proceso se toma un frasco con medio de cultivo se quita el sello, tomar con una
pinza (previamente esterilizada) el explante y se coloca dentro del medio de
cultivo, esto cuidando que la yema quede hacia arriba, así también es
importante hacer esto cerca del fuego y no introducir la mano dentro del frasco
con el medio de cultivo, es también de mucha importancia no colocar la tapa
boca abajo ni tocar la parte interior de la misma. Una vez sembrado el explante
se cierra fuertemente el frasco y de esterilizan de nuevo las pinzas para
realizar el mismo procedimiento al sembrar el siguiente explante.
6.6 sellado de los frascos
Una vez
sembrado todos los explantes se realiza el sellado de los frascos, primero se
cierra fuertemente con la tapa para después sellarlos con Parafilm y se
colocaron en el estante a la luz del sol a una temperatura ambiente.
6.7 Lavado del material
Una vez
concluida la práctica se realizó el lavado del material que se utilizo así
también se apagó la campana de flujo.
VII. Resultados
La práctica se realizó
atendiendo todas las medidas asépticas necesarias, el material utilizado, fue
esterilizado previamente; cada una de las actividades se realizaron dentro de
la campana de flujo laminar para evitar cualquier contaminación por
microorganismos (hongos, bacterias). La campana fue previamente desinfectada
con alcohol y colocó dentro de ella un mechero encendido.
El compañero que realizó la
siembra del material vegetal, se desinfectó previamente con jabón y alcohol al
70%, figura 1. El cloro utilizado se preparó dentro de la cámara de flujo
laminar, se tomó un frasco con 2/3 de
agua estéril y agregó 1/3 de cloro, figura 2.
Una vez que se había preparado el cloro, se prosiguió a la desinfección del
material vegetal, se tomó cada uno de los explantes y se introdujeron al frasco
que contenía el cloro, dejando éstos por 5 minutos, agitándolo en ocasiones;
cuando transcurrió el tiempo, se prosiguió a retirar el cloro de los explantes
para realizar el primer lavado con agua estéril durante 1 minuto; cuando pasó
el tiempo, se retiró el agua y realizó el segundo lavado nuevamente con agua
destilada pero ahora por 5 minutos, por
último se retiró el agua estéril, figura 3.
Fig 3: Desinfección del
material vegetal.
Con los explantes desinfestados,
se prosiguió a realizar el corte de las partes que quedaron quemadas por el
cloro. Se tomó el primer explante con una pinza y se colocó en una caja de
Petri para realizar el corte con un bisturí, para realizar el corte del segundo
explante, se tomó la pinza y el bisturí e introdujeron a un frasco con alcohol,
posteriormente fueron flameadas en el mechero y así realzó el segundo corte;
para realizar los siguientes cortes, las herramientas fueron esterilizadas en
alcohol y flameadas en el mechero. Cada uno de los explantes ya cortados fueron
colocados en la caja de Petri para realizar la siembra en el medio de cultivo,
figura 4.
Fig 4: Corte de los explantes
Para realizar la siembra de los explantes,
cada uno de ellos se tomó con una pinza estéril y fueron introducidos a los
frascos con medio de cultivo, estos se colocaron con la yema hacia arriba; cabe
mencionar que para cada siembra la pinza fue esterilizada con alcohol y
flameada con el mechero; cada frasco con el explante fue sellado y colocado en
el área de incubación, figura 5.
Fig 5: Siembra del material vegetal:
En un
máximo de 72 horas se observan los resultados obtenidos en la práctica, como
material vegetal que está creciendo, contaminado o muerto. Los resultados
obtenidos fueron:
VIII. Conclusiones y recomendaciones
En la
práctica se obtuvo un 0% de contaminación en los medios de cultivos; esto lo
redituamos a que la siembra del material vegetal se realizó atendiendo a todas
las medidas asépticas necesarias, ésta se realizó en la campana de flujo
laminar del laboratorio de usos múltiples; aunado a ello, el compañero que
realizó la siembra lo hizo de una manera adecuada, siempre desinfectando las
manos cuando estas salían de la campana de flujo laminar, el material utilizado
como las herramientas fueron correctamente esterilizadas así como el material
vegetal desinfestado.
También se
debe el éxito de la práctica a la buena explicación dada por el profesor
encargado Francisco Puche Acosta, pues
de no haber dado una excelente explicación, la práctica hubiese sido un
fracaso.
Es
importante que la siembra del material vegetal se realice tomando todas las
medidas asépticas necesarias, pues de esto depende el éxito o fracaso del
crecimiento y desarrollo del material vegetal.
IX. Bibliografía
ü
* Sedjo, R.A. 1997. El
sector forestal: innovaciones importantes. Documento
de debate 97-42. Recursos para el
Futuro, Washington
ü * Poepp. Et al,. Embriogénesis
somática como alternativa potencial para la regeneración in vitro del
género Nothofagus. UACH. 59–74p.
ü
* Hoffmann, A. 1982. Flora Silvestre de Chile. Zona
Austral. Fundación Claudio Gay. Santiago, Chile. Editorial Lord Cochrane. P: 258
ü * Gutiérrez, B. 2000. Áreas productoras de semillas en el mejoramiento
genético Instituto Forestal. P: 215–235.
* * Ipinza, R., y J. Espejo. 2000. Biología
Reproductiva en Nothofagus. Domesticación y Mejora Genética de Raulí y
Roble. Universidad Austral de
Chile/Instituto. Forestal. P: 75–93.
ü
* Ikemori,
Et al. 1994. Integrating biotechnology into Eucalyptus breeding. Tokio,
Japan. P: 77–84.
ü
* Castellanos
et al., 2005. In vitro propagation of Nothofagus P: 58.
ü
*Caplin y Steward 1948, 1952.
Anexos
1)
Que son los explantes:
R= Los
explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células
sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas.
2) Menciona algunos explantes y que crees que se podría
micropopagar con los mismos:
Meristemos apicales y las yemas axilares
(genéticamente muy estables), sirve para reproducir múltiples clones de una
forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el
cultivo. Yemas adventicias (genéticamente inestables)
producen un alto grado de variabilidad en los clones, no es útil para la
producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero sí
lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es
posible obtener nuevas líneas de cultivo.
3) Una vez que se ha obtenido el explante, este
debe ser correctamente desinfectado. ¿Para qué?
R= para evitar la proliferación de
contaminantes biológicos tales como bacterias, hongos y levaduras
principalmente en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del
explante y por ende compiten con él
mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo.
4) A donde son transladados los explantes
desinfectados:
R= son trasladados a una cámara de flujo
laminar la cual proporciona aire filtrado, libre de microorganismos.
5) Que es lo que se lleva a cabo en la cámara de
flujo laminar y en la cámara de crecimiento que
condiciones encontramos para un explante:
R= se lleva a cabo la transferencia a un
medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo.
Una vez que el explante está en el medio, se sella el frasco de cultivo y se
traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y
fotoperiodo controladas para su desarrollo.
6) Después de algunas semanas a donde se
traslada el cultivo ya que este ha desarrollado algunas raíces y hojas:
R= se realiza el traspaso al invernadero.
