PRACTICA 2

SEP                                      SNEST                             DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.

PRÁCTICA NO. 2

“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES”

  

QUE PRESENTAN:

FLOR DEL CARMEN DORANTES NAVA

ZULAI ESPINOZA AVIANEDA

LUIS ANTONIO FLORES HERNÁNDEZ

FANNY IMELDA PASTENES FELIZOLA 

DEYANIRA VERGARA PÉREZ

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

CIUDAD ALTAMIRANO, GRO. MÉXICO. 20 FEBRERO DEL 2012

“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES”

¹Dorantes N.F.C., ¹Espinoza A.Z., ¹Flores H.L.A., ¹Pastenes F. F. I.,  ¹ Vergara P.D.

¹Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano

RESUMEN

El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología del tecnológico de Cd. Altamirano, teniendo como objetivos conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza química y bioquímica, así como manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos y por último comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo. Para ello fue necesario realizar los cálculos de los sulfatos, se prosiguió a pesar cada una de las sustancias en la balanza analítica, posteriormente se agregaron cada una de éstas a un vaso de precipitado con 100ml de agua destilada, disolviendo hasta formar una solución homogénea, a continuación se aforó la solución a 200ml; por último se vació a un botella color ámbar y se guardó ésta en el refrigerador.

Palabras claves: soluciones stock, reactivos, sulfatos, balanza analítica.

ABSTRACT

This work was carried out in the microbiology laboratory of Ciudad Altamirano technology, with the objective to know the different components of culture medium and the nature of chemistry and biochemistry, and manage the basic techniques through proper use of reagents and finally understand the nutritional components of the culture media. This involved the calculations of sulfates, was continued despite each of the substances on the analytical balance, then added each of them to a beaker with 100 ml distilled water, dissolving to form a homogeneous solution, then the solution was decanted to 200ml and finally emptied an amber bottle and stored it in the refrigerator.

Keywords: stock solutions, reagents, sulfates, analytical balance

INDICE

I.      ANTECEDENTE.......................................5

II.    DEFINICIÓN DEL PROBLEMA..........................7

III.  OBJETIVOS........................................8

IV.    JUSTIFICACIÓN....................................9

V.      FUNDAMENTO TEORICO...............................10

VI.    MATERIALES Y METODOS.............................12

6.1 identificación de sulfatos....................12

6.2 pesado de los sulfatos........................12

6.3 preparación de la solución....................12

VII.  RESULTADOS.......................................13

7.1 informe escrito de las actividades.............13

7.2 pesado de los solutos..........................15

VIII.    CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES..................16

8.1        conclusiones................................16

8.2        recomendaciones.............................16

IX.    BIBLIOGRAFIA......................................17

X.      ANEXOS.............................................18

I. ANTECEDENTES

Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro": por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina, tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, biotina, y ácido fólico. Aminoácidos tales como L-glutamina, asparragina y cisteína, los hexitoles como mioinositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agente gelificante.

Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.

Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color ámbar durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación. Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución. En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos.

Desde el punto de vista práctico la preparación de soluciones madres o stock tiene como finalidad evitar:

1. Pesar cada uno de los compuestos químicos que constituyen un medio de cultivo, cada vez que se requiera elaborar, lo que implicaría evitar demasiado tiempo en su preparación.

2. Inexactitud al pesar cantidades muy pequeñas de ciertos compuestos químicos.

Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se utilice para disolver las sales inorgánicas que constituyen las soluciones stock y en general el medio de cultivo.

El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte & Kleyn, 1996). Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Para tener éxito el cultivo de tejidos vegetales es de suma importancia colocar las soluciones en el medio de cultivo con las concentraciones adecuadas, por esta razón es necesario que el alumno aprenda a realizar las soluciones madre  con las cantidades de soluto y solvente requeridas en cada una de las soluciones, así como también es necesario que se aprenda a realizar los cálculos matemáticos correspondientes  a cada una de las soluciones para el medio de cultivo.

III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Conocer la preparación de las soluciones stock para los medios de cultivo ms.

OBJETIVO ESPECIFICO

·         Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica.

·         Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.

·         Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.

IV. JUSTIFICACIÓN

Las plantas requieren de ciertos nutrientes para poder crecer y desarrollarse de manera satisfactorios, de igual manera el cultivo de tejidos in vitro, requiere de ciertas condiciones y nutrientes para su optimo desarrollo; las soluciones stock son de gran importancia para la preparación de los medios de cultivo de tejido ya que estas se encuentran en concentraciones que son requeridas para los cultivos vegetales, por esta razón es importante que el alumno conozca la forma de prepararlas, teniendo los conocimientos adecuado para realizar los cálculos requeridos y manejo de éstas.

V. FUNDAMENTO TEÓRICO

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas; avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, T Merlín 2003).

El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular. La totipotencia es la capacidad que tiene una célula somática de regenerar un planta completa e igual a la planta madre. (Radice, T. et al  1983)

Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o manipuladas genéticamente, se propagan o regeneran vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación vegetativa para erradicar infecciones por virus, lograr la propagación de especies en las cuales es difícil hacerlo naturalmente, y para introducir variaciones genotípicas que aumenten la calidad de los productos.

Con la aplicación de la técnica de micro propagación de plantas, se amplían las perspectivas de obtención de material vegetal con mejor calidad agronómica y en cualquier época del año (Alberti et al. 1992). Para el desarrollo de esta técnica, deben considerarse aspectos fundamentales, como la procedencia, selección y desinfección del explante, así como la composición de los medios de cultivo a utilizar en cada una de las etapas y las condiciones de crecimiento (Navarro y Perea 1996).

Uno de los mayores usos del cultivo de tejidos es la propagación vegetativa de plantas con el fin de disponer de gran cantidad de material vegetal fitosanitariamente sano (Pasqual y Ferreira 2007).

VI. MATERIALES Y METODOS

6.1 Identificación de los sulfatos

Los sulfatos necesarios para la preparación del medio ms, fueron sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, sulfato de zinc y por último sulfato de cobre, cada uno de estos fueron extraídos del cuarto de los reactivos.

6.2 Pesado de los sulfatos

Una vez identificado cada uno de los sulfatos, se prosiguió a pesar en la balanza analítica  7.4g de MgSO₄7H₂O, .338g de MnSO₄4H₂O, .0172g de ZnSO₄7H₂O y .0005g de CuSO₄5H₂O, cada uno de ellos por separado en una laminilla de aluminio para poder obtener un pesado exacto y preciso

6.3 Preparación de la solución

Cuando se tuvieron los solutos pesados, posteriormente se agregaron cada una de ellas a un vaso de precipitado con 100ml de agua destilada, moviéndolas con un agitador con el fin de obtener una solución homogénea, se  prosiguió a aforarla en una probeta graduada a 200ml; por último se vertió  la solución elaborada en una botella color ámbar y tapó con papel aluminio e introdujo al refrigerador, hasta su próxima utilización.

VII. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1 Informe escrito de las actividades

Primeramente se realizó los cálculos de la solución  stock para el medio MS concentrados a 100X y a una solución de 200ml para Sulfatos ver Fig. 1Para que  una vez teniendo los cálculos se pudieran pesar en la balanza analítica; esto se realizó de la siguiente manera aunada a los siguientes datos:

MgSO₄ 7H₂O -------------------------- 0.370

MnSO₄ H₂O ---------------------------- 0.0169

ZnSO₄ 7H₂O --------------------------- 0.0086

CuSO₄ SH₂O -------------------------- 0.000025

Fig.1 MgSO_4, MnSO₄, ZnSO_4, CuSO₄

_{CALCULOS DE LOS SULFATOS}

7.2 Pesado de los solutos en la balanza analítica

Una vez que se obtuvo los resultados de los cálculos del medio ms para realizar las soluciones stock se prosiguió a pesar cada uno de los sulfatos  cuidadosamente en la balanza analítica de forma ordenada como se muestra en las figuras, posteriormente se agregaron al vaso de precipitado que contenía agua destilada y se diluyo, para posteriormente agregar el medio de sulfatos a la botella ÁMBAR. Ver Fig. 2.

Figura 2: pesado de los solutos

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

7.1 Conclusiones

Se logró preparar una solución sulfatos de 200ml a con una concentración de 100X exitosamente, aunque debido a las malas especificaciones del profesor no se logró realizar la solución la primera vez, sino que esta se realizó exitosamente en la segunda ocasión. Una vez tenida la solución de sulfatos  con la concentración correspondiente, se puso en una botella de vidrio y se guardó en el refrigerador a una temperatura de 4°C aproximadamente.

Con esta práctica se logró que el alumno aprendiera a preparar las soluciones madre, también se aprendieron a realizar los cálculos matemáticos necesarios para preparar la solución, así como la importancia que tienen cada uno de los componentes en el medio de cultivo y lo que ocasiona si nuestra solución no está concentrada en los parámetros establecidos para el cultivo de tejidos vegetales, esto es de suma importancia ya que de esto va a depender si nuestro tejido vegetal se desarrolle en nuestro medio in vitro.

7.2 Recomendaciones

Se recomienda que revisar varias veces los cálculos matemáticos de las concentraciones de cada uno de los componentes de los medios de cultivo ya que un error en el cálculo de alguno de los sulfatos cambia en gran medida la concentración de nuestra solución, también se recomienda que el profesor especifique bien las sustancias que se agregaran en cada uno de los compuestos así también se recomienda a los alumnos llevar acabo todos pasos necesarios y revisar el formato de la práctica, pedir ayuda al profesor en caso de tener una duda en alguno de los pasos que se especifican en la práctica, de igual forma se recomienda que se pesen exactamente cantidades adecuadas de cada uno de los sulfatos, es importante que los sulfatos se diluyan bien para después aforarlos en la concentración de agua destilada correspondiente. 

IX. BIBLIOGRAFIA

- Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe y I.K. Vasil. 1976. Plant Tissue  Culture Media. In Vitro 12(7): 473-478.

- Ozias-Akins, P. y I.K. Vasil.  1985. Nutrition of Plant Tissue Cultures. En: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Ed. I.K. Vasil., V.2. pags. 129-147.

- Pierik, Ir. R.L.M. 1984.  In vitro culture of Higher plants. Department of  Horticulture Agricultural University, Wageningen, 107 pags.

- Reinert, J. y Yeoman, J.J. 1982. Plant  Cell and Tissue Culture. A Laboratory  Manual. Ed.Springer-Verlag, Berlín, 83 pags

- Street, H.E. y L.A. Whiters. 1974. The anatomy of embryogenesis in culture. En: Tissue culture & Plant Science. H.E. Street (Ed.) Ed. Acad. Press, Londres, pp. 71-100.

X. ANEXOS

¿Qué es un medio de cultivo?

R= formulación químicamente definida, donde los explantes (plantas) encuentran las condiciones para desarrollar su potencial intrínseco.

¿Qué es una solución stock?

R=  solución concentrada de nutrientes o de fitohormonas.

¿Sustancias para preparar un cultivo ms.?

R= Nitratos, Sulfaots, Quelatos, Po Bo Mo, Halogenos, Organicos, A.N.A., Sacarosa, Phytagel.

PRACTICA 1

SEP                                    SNEST                                      DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.

  

PRÁCTICA No.1.

RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS.

QUE PRESENTAN:

Fanny Imelda Pastenes Felizola 

Deyanira Vergara Pérez

Zulai Espinoza AVianeda

Flor del Carmen Dorantes Nava

Luis Antonio Flores Hernández

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Ciudad Altamirano, Gro. México. 20 Febrero del 2012

“RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS”

¹Dorantes N.F.C., ¹Espinoza A.Z., ¹Flores H.L.A., ¹Pastenes F. F. I.  ¹ Vergara P.D.

¹Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo conocer las diferentes áreas y equipos del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, así  mismo conocer las normas de comportamiento y seguridad dentro del mismo. Posteriormente  se  realizo la visita a las instalaciones del  laboratorio del Instituto Tecnológico de ciudad Altamirano, de esta Ciudad, consecutivamente se dio a conocer las normas y la seguridad del laboratorio,  respectivamente se anoto en una libreta de apunte  las áreas las cuales se encontró dentro del laboratorio, entre ellas se encontró el área de preparación de medios, área de lavado y esterilización, área de transferencia y siembra, etc., así mismo se anoto las soluciones dentro del área de preparación., por el cual el resultado esperado fue de gran importancia para nosotros como alumnos investigadores ya que sí se logró reconocer las áreas dentro del mismo, así como también la seguridad y el comportamiento que se debe tener dentro del laboratorio de cultivo de tejidos, con ello se demostró que un laboratorio de cultivo de tejido es de gran importancia para realizar propagaciones in vitro, tomando un explante de la planta, utilizando hormonas de crecimiento vegetal, de acuerdo con lo planteado  se alcanzo el objetivo presente en esta práctica.

Palabras claves: áreas del laboratorio, cultivo de tejidos, propagación in vitro, explante, Hormonas de crecimiento vegetal.

ABSTRACT

This work aimed to identify the different areas and laboratory equipment plant tissue culture, likewise know the rules of behavior and safety within it. Subsequently conducted a visit to the laboratory facilities of the Technological Institute of Ciudad Altamirano, of this City, was released consecutively standards and laboratory safety, respectively, were scored in a Record Book which areas are found within the laboratory, including the area found media preparation, washing and sterilization area, and seeding transfer area, etc.., likewise be scored the solution within the staging area., whereby the expected result was veryimportance to us as researchers and students were also recognized that other areas within it, as well as safety and behavior that should be within the tissue culture laboratory, it was demonstrated with a laboratory tissue culture is of great importance for propagation in vitro, using a plant explant, using plant growth hormones, raised according to the present purpose is reached in practice. 

Keywords: areas of the laboratory, tissue culture, propagation in vitro, explant, plant growth hormones. 

ÍNDICE

                                                                                                                      PÁGINA

Antecedentes……………………………………………………………………………………………………………5

Definición del problema………………………………………………………………………………6

Objetivos..………………………………………………………………………………………………………………7

Justificación…………………………………………………………………………………………………………8

Fundamento teórico……………………………………………………………………………………………9

Materiales y Métodos……………………………………………………………………………………13

Resultados………………………………………………………………………………………………………………16

Conclusiones y Recomendaciones…………………………………………………………22

Fuentes consultadas………………………………………………………………………………………23

Anexos…………………………………………………………………………………………………………………………25

I.      ANTECEDENTES

      Jaime Izasa Cadavid del instituto politécnico de Colombia mencionó que el laboratorio sirve de apoyo para el área de la Biotecnología Vegetal, específicamente para la asignatura Cultivo de Tejidos Vegetales in vitro y otras relacionadas con el sector agrícola (Sanidad vegetal, Control Biológico). Debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos o bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado.

       W. M. Roca y L.A. Mroginski, establecieron que el laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un área destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de investigación y desarrollo y en los de producción comercial. La decisión de establecer un laboratorio de cultivo de tejidos requiere de un estudio y análisis crítico acerca de la necesidad de hacerlo, el establecimiento y funcionamiento de un laboratorio debe ser, idealmente, el producto de esfuerzos multidisciplinarios.

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Los laboratorios están estructurados en áreas donde se realizan procesos específicos; cada una de ésta cuenta con el material y equipo adecuado, por ello es importante que cada uno de los alumnos y docentes conozcan la ubicación y el uso de cada área, así como el material que éstas poseen, sin dejar atrás las normas establecidas en el mismo, con la finalidad de realizar las prácticas con éxito.

III. OBJETIVOS

• Conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
• Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio.

IV. JUSTIFICACIÓN

El presente trabajo se realizo con el fin de tener conocimiento sobre las áreas que existen dentro del laboratorio de tejidos de cultivos vegetales, así como también los alumnos investigadores reconozcan como llevar a cabo un cultivo de tejido vegetal, que material utilizar y en qué área llevar a cabo cada uno de estos pasos,  sobre todo que soluciones realizar para llevar a cabo la preparación.

V. FUNDAMENTO TEORICO

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas; avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, T Merlín 2003).

Estos principios son básicamente invariables en todos los laboratorios de cultivo de tejido vegetal, su aplicación puede presentar variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio; así, mientras que un laboratorio de investigación puede ser pequeño en tamaño pero muy especializado en equipos e instalaciones, uno de producción comercial tiende a ser más grande y simple. Un laboratorio de investigación puede también tener un rol de enseñanza y, en este caso, es frecuente que se asignen en él áreas especiales para la enseñanza y la demostración (Roca & Mroginski 1982).

Es muy importante contar con   todas las áreas indispensables para los laboratorios de biotecnología vegetal, ya que cada una de ellas cumple funciones importantes dentro de las prácticas, y observando   las diferenciaciones de estas, dentro del  laboratorio. También debe contar con una buena climatización, del área de trabajo, que es primordial para el buen desempeño de las prácticas. (Flaschka, h. a 1980)

El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular. La totipotencia es la capacidad que tiene una célula somática de regenerar un planta completa e igual a la planta madre. (Radice, T. et al  1983)

El laboratorio de tejidos debe disponer de un área destina al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta área es especialmente necesaria especialmente en los laboratorios de investigación y desarrollo y en los de producción comercial. Aquellos laboratorios que se dedican a la producción y distribución de materiales de sanidad certificada, por ejemplo, deben incluir además facilidades para la cuarentena y para la evaluación fitosanitaria.

Finalmente, la decisión de establecer un laboratorio de cultivo de tejidos requiere de un estudio y análisis crítico acerca de la necesidad de hacerlo, dentro de un contexto integral del desarrollo de la investigación y la producción agrícola o forestal  de una región o país. Por lo tanto, el establecimiento y funcionamiento del laboratorio debe ser, idealmente el producto de esfuerzos multidisciplinarios. Existen recomendaciones para la planificación de ciertos tipos de laboratorios; como ejemplo se pueden mencionar las relacionadas con la propagación masiva de fresas (Boxus et al., 1984).

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en la práctica sin embargo, algunas de las funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente. Las áreas o secciones  principales son:

Área de preparación. Se utiliza principalmente para preparar los medios del cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenarlos materiales de vidrio y de plásticos, y los reactivos químicos. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colar las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación y otros elementos.

Áreas de lavado y de esterilización. Puede estar constituida por dos áreas conectadas  entre sí, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación. Esta área de lavado debe  incluir por lo menos un lavado grande de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para el efecto se debe usas un destilador de vidrio o de material no tóxico y un desionizador de agua colocado entre el destilador y el lavadero. El área de esterilización debe tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión).

Área de transferencia. En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de escisión inoculación y transferencia de los explantes  a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión o la construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas operaciones de inoculación, como la excisión y el cultivo de ápices y meristemos en tubos de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.

Área de incubación. Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o gabinetes o cámaras de crecimiento; éstas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas. En el cuarto de incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos. Estas estanterías pueden tener dimensiones variables.

Área de observación y examen. Generalmente los microscopios (estéreo, compuesto, invertido y otros) se localiza tanto en el área de incubación como en la de transferencia, pero opcionalmente pueden estar en un área separada. El objetivo de esta área es realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como en  líquidos.

Área de crecimiento. Las plantas que se regeneran en el área de incubación se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Estas operaciones se pueden llevar a cabo en tinglados, cas de malla o invernadero, dependiendo delas condiciones climáticas del lugar donde ésta ubicado el laboratorio y de los requerimientos de aislamiento de los materiales por razones fitosanitarias. Después del trasplante, las plantas generalmente necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones de campo, lo cual se puede lograr usando nebulización húmedas de plásticos, etc.

Material de laboratorio. Suponiendo que se establecerá un laboratorio de cultivo de tejidos de tamaño, medio, se requieren, para ponerlo  en funcionamiento, las siguientes piezas del equipo estándar:

En el área de preparación: refrigerador, balanza (una macrobalanza y una de precisión). Potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos Erlenmeyer, botellas y material de vidrio o plástico

En el área de lavado y esterilización: autoclave manual o automática, destiladora de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para esterilización y secado.

En el área de trasferencia: gabinetes de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente, e instrumentos de disección: cuchillas, mangos para las cuchillas, pinzas, tijeras, navaja de afeitar, bandejas,  y tacho para basuras.

En el área de incubación: un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas; estanterías con iluminación. (Roca, W. M, Mroginski 1982)   

VI. MATERIALES Y MÉTODOS.

6.1 Organización de los estudiantes en grupo

Para entrar al laboratorio fue necesario hacer equipos organizados de alumnos, con la finalidad de realizar una práctica al 100% satisfactoria, ya que al trabajar en colectivo, los conocimientos son enriquecidos por cada uno de los integrantes.

6.2 Recorrido y descripción de las áreas del laboratorio y sus equipos respectivos

Mediante la observación visual se reconocieron las áreas que comprende el laboratorio de tejidos de cultivo, así como el equipo y material con el que cuenta cada una de ellas, para ello fue necesario hacer uso de un bolígrafo, una libreta de apuntes, contemplando en ésta cada una de las áreas apreciadas, con la finalidad de obtener información más detallada se hizo uso de una cámara fotográfica con la cual se obtuvieron imágenes representativas de cada uno de los sitios visitados.

Además del reconocimiento y material de cada área, se discutió sobre la función de cada una de ellas, así como la manera de darle un buen uso a éstas.

6.2.1 Áreas de preparación de medios de cultivos

Para la preparación de los medios de cultivo se lleva a cabo en una mesa, la cual se esteriliza utilizando agua y jabón para lavarla, posteriormente se desinfecta con alcohol. Se cuenta con anaqueles para colocar los materiales de vidrio y de plástico, en los cuales se encontraran probetas graduadas, pipetas, vasos de precipitado, agitadores, termómetros, pinzas, matraz erlenmeyer, embudo de separación, cajas de petri, vidrio de reloj, etc.

Así mismo existe un área donde se puede encontrar los reactivos y sustancias químicas, dicha área se encuentra protegida y en condiciones optimas para su conservación. Como todo laboratorio se cuenta con refrigeradores donde se guardan sustancias y muestras que requieren de refrigeración.

6.2.2 Área de lavado y esterilización

El laboratorio cuenta con lavaderos con agua a temperatura ambiente, éstos tienen tubería y drenaje, son de metal y se encuentran en condiciones favorables. Al no contar con una instalación con agua esterilizada, en el laboratorio se hace el agua esterilizada o por su defecto se compra. Se cuenta con una estufa pequeña para esterilizar algunos materiales, los depósitos de la basura no son del todo adecuados para el laboratorio.

6.2.3 Área de transferencia y siembra

Actualmente presenta dos cámaras de flujo laminar para llevarse a cabo la siembra, pero solo una de ellas es la que se encuentra en mejores condiciones, por tal motivo se requiere de un buen cuidado y manejo.

6.2.4 Área de incubación

Esta es una de las áreas primordiales en el laboratorio de cultivo de tejidos, sin embargo no existe como tal, por esta razón ésta se adecuará para tal función.

VII. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1 Áreas del laboratorio

Todo laboratorio sea cual sea su especialización (de microbiología, de análisis, químico, etc.), se encuentra estructurado en áreas, las cuales tienen funciones específicas; el laboratorio de cultivo de tejidos del tecnológico de Cd. Altamirano no es la excepción aunque este no presenta las áreas marcadas, se pueden adecuar, tal es el caso del área de incubación.

El laboratorio de cultivo de tejidos del tecnológico presenta las siguientes áreas:

   AREA DE PREPARACIÓN

FUNCIÓN: aquí se realiza la preparación de los medios de cultivo.

MATERIAL:

o   Materiales de vidrio: vasos de precipitado, frascos, matraz elermeyer (125, 250 y 500 ml)

o   Material de plástico: probeta graduada

o   Reactivos

EQUIPO: balanza analítica, medidor de pH, platos calientes con agitación, refrigerador, incubadora, cámara de crecimiento, potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético.

   AREA DE LAVADO Y DE ESTERILIZACIÓN

FUNCIÓN: en este espacio se realiza el lavado y la esterilización del material a utilizar para la preparación de los medios de cultivo.

MATERIAL PARA EL AREA DE LAVADO: Lavadero, agua caliente, agua fría y agua destilada, basurero para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se desechen, gradillas para el secado.

En esta misma área se encuentra el refrigerador, ya que esta alberga material de microbiología, biología

MATERIAL PARA EL AREA DE ESTERILIZACION: Autoclave (olla de presión), estufa, lavadero, destilador de vidrio

   AREA DE TRANSFERENCIA

FUNCIÓN: en esta área se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia del material vegetal (explantes) a los medios de cultivo.

MATERIAL: tubos de ensayo de boca angosta, navaja o bisturí, mesas, instrumentos de disección, frascos con alcohol, máscaras, mechero de alcohol, bandejas, guantes, marcadores de aceite, bote de basura.

EQUIPO: gabinetes de flujo laminar, microscopio.

   AREA DE INCUBACION

FUNCIÓN: en esta parte del laboratorio se realiza la incubación, es importante que se encuentre a temperatura constante

MATERIAL: gradillas para tubos

EQUIPO: cámara de crecimiento, estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos, aire acondicionado

Es importante recalcar que el laboratorio no cuenta con esta área como tal, pero ésta se adecuará para tal función.

   AREA DE OBSERVACIÓN Y EXAMEN

FUNCIÓN: en esta área se lleva a cabo el análisis periódico de los cultivos realizados

EQUIPO: microscopio, estereoscopio.

Las áreas que se muestran a continuación no las presenta el laboratorio, pero son vitales en un laboratorio de cultivo de tejidos.

   AREA DE CRECIMIENTO

FUNCIÓN: una vez que los cultivos pasaron al área de incubación, las plantas son trasplantadas en un recipiente; posteriormente son llevadas a un sitio propiamente acondicionado y cubierto en el techo con una maya.

MATERIAL: macetas, suelo, bandejas.

EQUIPO: aire acondicionado, cámaras húmedas de plástico

   AREA DE CUARENTENA Y CONTROL FITOSANITARIO

FUNCIÓN: esta es el área de recepción de las muestras o plantas contaminadas (virus, bacterias, hongos) destinadas a la limpieza clonal; para ello se encuentra protegida de insectos; cabe mencionar que es un espacio separado del laboratorio para evitar la infestación de otras muestras.

7.2 Organización de los reactivos

El laboratorio además presenta un área donde se almacenan los reactivos y sustancias como las sales para la preparación de los medio de cultivo, los cuales se concentran en un estante; las sales se pueden identificar por su tapadera azul y el nombre de J. T. Baker.

7.3 Normas de comportamiento

      Las normas de seguridad de los laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, con el fin de evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo como hacia el exterior.

      Las reglas básicas que se establecen en un laboratorio son un conjunto de prácticas de sentido común que se deben realizar en forma rutinaria al ingresar a este.

     El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio.

• Es importante reconocer  los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: extintores, salidas de emergencia, lavaojos.
• El laboratorio cuenta con un botiquín de primeros auxilios en caso de ser necesario.
• No se permite ingresar alimentos ni bebidas.
• Se bebe introducir al laboratorio con la vestimenta apropiada: bata, zapatos cerrados, cabello recogido, guantes, cubre boca
• Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada equipo es responsable directa de la zona que le ha sido asignada.
• Las manos deben lavarse después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
• No se permite correr dentro del laboratorio
• Es importante cubrirse la cara de salpicaduras; para ello se debe utilizar anteojos de seguridad y cubre bocas.
• Se debe hacer uso adecuado del material toxico y flameable 

Así que es importante que como alumnos tomemos las medidas de seguridad correspondientes para evitar algún percance, siempre atendiendo a las reglas establecidas en el laboratorio. 

 

VIII.CONCLUSION

Es importante que cada laboratorio cuente con las áreas y el material adecuado para realizar los procesos, técnicas y procedimientos de una manera veraz y precisa, con la finalidad de obtener en cada una de las prácticas resultados satisfactorios.

Por otro lado es necesario conocer y poner en práctica cada una de las reglas o normas creadas en el laboratorio, puesto que estas se establecieron con la finalidad de prevenir accidentes en caso de hacer mal uso de las instalaciones, equipos y sustancias que existen en él, así mismo poner en práctica los valores entre los alumnos que hacen uso de esta estancia.

Aunque el laboratorio del tecnológico no cuenta al 100% con las instalaciones o áreas requeridas para el cultivo de tejidos, se aprovecha al máximo las aéreas y el equipo con el que se cuenta.

IX. FUENTES CONSULTADAS

Ø  Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John Innes Symposium the Plant Genoma and Second.

Ø  Roca & Mroginski. (1982). Experimentes in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press.

Ø  Dixon, R.A. (1986). Plant Cell Culture A Practical Aproch, I. R. L., Press Washington D.C.

Ø  Evans, D.A. ET, al. (1983). Handbbook of Plant Cell Culture Vol.I, II, III y IV. McMillan Publishing Co. New York.

Ø  Helgeson, J.P. and B.J. Deveral (1983). Use of Tissue Culture and Protoplast in Plant Pathology. Academic Press. New York.

Ø  Clifton, E Meloan (1973). Problemas y Experimentos en Análisis Instrumental. Editorial Reverte Mexicana, S. A. 1973. México

Ø  Flaschka, h. a (1980). Química Analítica Cuantitativa Vol. II. Compañía Editorial Continental S.A. México.

Ø  Garzón g. Guillermo (1989). “Fundamentos de Química General” serie Skgaum segunda edición.

Ø  Homer, D. Chapman (1979). Métodos de Análisis para suelos, plantas y aguas. Editorial Trillas. México.

Ø  Reina T. Merlín (2003). Análisis Químico Cuantitativo. Editorial Porrua. Saunders, L. Fisicoquímica para estudiantes de biología, farmacia y medicina

Ø  Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132.

Ø  Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronomía. 

Ø  Murashige T., Skoog F., 1962, A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97

Ø  Pierik R.L.M., 1990, Cultivo  in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid. www.scribd.com/.../hvRLSAS-RAI-LABORATORIO-DE-CULTIVO-.. 02:30 18/02/12