SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.
PRÁCTICA No.1.
QUE PRESENTAN:
Fanny Imelda Pastenes Felizola
Deyanira Vergara Pérez
Zulai Espinoza AVianeda
Flor del Carmen Dorantes Nava
Luis Antonio Flores Hernández
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
Ciudad Altamirano, Gro. México. 20 Febrero
del 2012
“RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE
TEJIDOS”
1Dorantes
N.F.C., 1Espinoza A.Z., 1Flores H.L.A., 1Pastenes
F. F. I. 1 Vergara P.D.
1Instituto
Tecnológico de Cd. Altamirano
RESUMEN
El presente trabajo tuvo
como objetivo conocer las diferentes áreas y equipos del laboratorio de cultivo
de tejidos vegetales, así mismo conocer
las normas de comportamiento y seguridad dentro del mismo. Posteriormente se realizo
la visita a las instalaciones del
laboratorio del Instituto Tecnológico de ciudad Altamirano, de esta Ciudad,
consecutivamente se dio a conocer las normas y la seguridad del laboratorio, respectivamente se anoto en una libreta de
apunte las áreas las cuales se encontró
dentro del laboratorio, entre ellas se encontró el área de preparación de
medios, área de lavado y esterilización, área de transferencia y siembra, etc.,
así mismo se anoto las soluciones dentro del área de preparación., por el cual
el resultado esperado fue de gran importancia para nosotros como alumnos
investigadores ya que sí se logró reconocer las áreas dentro del mismo, así como
también la seguridad y el comportamiento que se debe tener dentro del
laboratorio de cultivo de tejidos, con ello se demostró que un laboratorio de
cultivo de tejido es de gran importancia para realizar propagaciones in vitro, tomando un explante de la
planta, utilizando hormonas de crecimiento vegetal, de acuerdo con lo planteado
se alcanzo el objetivo presente en esta
práctica.
Palabras claves: áreas
del laboratorio, cultivo de tejidos, propagación in vitro, explante, Hormonas de crecimiento vegetal.
ABSTRACT
This work
aimed to identify the different areas and laboratory equipment plant tissue
culture, likewise know the rules of behavior and safety within it. Subsequently conducted a visit to the
laboratory facilities of the Technological Institute of Ciudad Altamirano, of
this City, was released consecutively standards and laboratory safety,
respectively, were scored in a Record Book which areas are found within the laboratory, including the area found
media preparation, washing and sterilization area, and seeding transfer area,
etc.., likewise be scored the solution within the staging area., whereby the
expected result was veryimportance to us as researchers and students were also
recognized that other areas within it, as well as safety and behavior that
should be within the tissue culture laboratory, it was demonstrated with a
laboratory tissue culture is of great
importance for propagation in vitro, using a plant explant, using plant growth
hormones, raised according to the present purpose is reached in practice.
Keywords:
areas of the laboratory, tissue culture, propagation in vitro, explant, plant
growth hormones.
ÍNDICE
PÁGINA
Antecedentes……………………………………………………………………………………………………………5
Definición del problema………………………………………………………………………………6
Objetivos..………………………………………………………………………………………………………………7
Justificación…………………………………………………………………………………………………………8
Fundamento teórico……………………………………………………………………………………………9
Materiales y Métodos……………………………………………………………………………………13
Resultados………………………………………………………………………………………………………………16
Conclusiones y Recomendaciones…………………………………………………………22
Fuentes consultadas………………………………………………………………………………………23
Anexos…………………………………………………………………………………………………………………………25
I.
ANTECEDENTES
Jaime Izasa Cadavid del instituto
politécnico de Colombia mencionó que el laboratorio sirve de apoyo para el área
de la Biotecnología Vegetal, específicamente para la asignatura Cultivo de
Tejidos Vegetales in vitro y
otras relacionadas con el sector agrícola (Sanidad vegetal, Control Biológico).
Debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos o
bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros asociados
al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en
un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado.
W. M. Roca y L.A. Mroginski,
establecieron que el laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un área
destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas
producidas; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de
investigación y desarrollo y en los de producción comercial. La decisión de
establecer un laboratorio de cultivo de tejidos requiere de un estudio y análisis
crítico acerca de la necesidad de hacerlo, el establecimiento y funcionamiento
de un laboratorio debe ser, idealmente, el producto de esfuerzos
multidisciplinarios.
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Los laboratorios están estructurados en áreas donde se realizan
procesos específicos; cada una de ésta cuenta con el material y equipo
adecuado, por ello es importante que cada uno de los alumnos y docentes
conozcan la ubicación y el uso de cada área, así como el material que éstas
poseen, sin dejar atrás las normas establecidas en el mismo, con la finalidad
de realizar las prácticas con éxito.
III. OBJETIVOS
- Conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
- Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio.
IV. JUSTIFICACIÓN
El presente trabajo se realizo con el fin de tener conocimiento
sobre las áreas que existen dentro del laboratorio de tejidos de cultivos
vegetales, así como también los alumnos investigadores reconozcan como llevar a
cabo un cultivo de tejido vegetal, que material utilizar y en qué área llevar a
cabo cada uno de estos pasos, sobre todo
que soluciones realizar para llevar a cabo la preparación.
V. FUNDAMENTO TEORICO
El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo
como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una
técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de
los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como
la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las
instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar,
incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes,
placas de Petri ventiladas; avances técnicos y la aparición de un buen número
de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo han hecho del
cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, T Merlín
2003).
Estos principios son básicamente invariables en todos los
laboratorios de cultivo de tejido vegetal, su aplicación puede presentar
variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del
laboratorio; así, mientras que un laboratorio de investigación puede ser
pequeño en tamaño pero muy especializado en equipos e instalaciones, uno de
producción comercial tiende a ser más grande y simple. Un laboratorio de
investigación puede también tener un rol de enseñanza y, en este caso, es
frecuente que se asignen en él áreas especiales para la enseñanza y la
demostración (Roca & Mroginski 1982).
Es muy importante contar con todas las áreas
indispensables para los laboratorios de biotecnología vegetal, ya que cada una de ellas cumple funciones importantes
dentro de las prácticas, y observando las
diferenciaciones de estas, dentro del laboratorio. También debe contar con una buena
climatización, del área de trabajo, que es primordial para el buen desempeño de
las prácticas. (Flaschka, h. a 1980)
El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la
totipotencialidad celular. La totipotencia es la capacidad que tiene una célula
somática de regenerar un planta completa e igual a la planta madre. (Radice, T.
et al 1983)
El laboratorio de tejidos debe disponer de un área destina al
establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta
área es especialmente necesaria especialmente en los laboratorios de
investigación y desarrollo y en los de producción comercial. Aquellos
laboratorios que se dedican a la producción y distribución de materiales de
sanidad certificada, por ejemplo, deben incluir además facilidades para la
cuarentena y para la evaluación fitosanitaria.
Finalmente, la decisión de establecer un laboratorio de cultivo
de tejidos requiere de un estudio y análisis crítico acerca de la necesidad de
hacerlo, dentro de un contexto integral del desarrollo de la investigación y la
producción agrícola o forestal de una región o país. Por lo tanto, el
establecimiento y funcionamiento del laboratorio debe ser, idealmente el
producto de esfuerzos multidisciplinarios. Existen recomendaciones para la
planificación de ciertos tipos de laboratorios; como ejemplo se pueden
mencionar las relacionadas con la propagación masiva de fresas (Boxus et al.,
1984).
Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir en áreas
separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en la práctica sin
embargo, algunas de las funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente.
Las áreas o secciones principales son:
Área de preparación. Se utiliza principalmente para preparar los
medios del cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenarlos
materiales de vidrio y de plásticos, y los reactivos químicos. Este ambiente
debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colar
las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación y otros
elementos.
Áreas de lavado y de esterilización. Puede estar constituida por
dos áreas conectadas entre sí, o por un
solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación.
Esta área de lavado debe incluir por lo
menos un lavado grande de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada;
para el efecto se debe usas un destilador de vidrio o de material no tóxico y
un desionizador de agua colocado entre el destilador y el lavadero. El área de
esterilización debe tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el
cual puede ser pequeño (olla de presión).
Área de transferencia. En esta área del laboratorio se realiza
el trabajo de escisión inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este
trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la
instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo
presión o la construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas
operaciones de inoculación, como la excisión y el cultivo de ápices y
meristemos en tubos de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una
mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y
polvo.
Área de incubación. Los cultivos se incuban en un cuarto
apropiado o gabinetes o cámaras de crecimiento; éstas pueden ser más eficientes
en cuanto al control ambiental, pero son más costosas. En el cuarto de
incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los
cultivos. Estas estanterías pueden tener dimensiones variables.
Área de observación y examen. Generalmente los microscopios
(estéreo, compuesto, invertido y otros) se localiza tanto en el área de
incubación como en la de transferencia, pero opcionalmente pueden estar en un
área separada. El objetivo de esta área es
realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos
como en líquidos.
Área de crecimiento. Las plantas que se regeneran en el área de
incubación se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas,
bandejas o camas apropiadas. Estas operaciones se pueden llevar a cabo en
tinglados, cas de malla o invernadero, dependiendo delas condiciones climáticas
del lugar donde ésta ubicado el laboratorio y de los requerimientos de
aislamiento de los materiales por razones fitosanitarias. Después del
trasplante, las plantas generalmente necesitan un acondicionamiento gradual a
las condiciones de campo, lo cual se puede lograr usando nebulización húmedas
de plásticos, etc.
Material de laboratorio. Suponiendo que se establecerá un
laboratorio de cultivo de tejidos de tamaño, medio, se requieren, para
ponerlo en funcionamiento, las
siguientes piezas del equipo estándar:
En el área de preparación: refrigerador, balanza (una
macrobalanza y una de precisión). Potenciómetro, plancha eléctrica con agitador
magnético, frascos Erlenmeyer, botellas y material de vidrio o plástico
En el área de lavado y esterilización: autoclave manual o
automática, destiladora de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio
y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para
esterilización y secado.
En el área de trasferencia: gabinetes de flujo laminar,
microscopio de disección con luz incidente, e instrumentos de disección:
cuchillas, mangos para las cuchillas, pinzas, tijeras, navaja de afeitar,
bandejas, y tacho para basuras.
En el área de incubación: un cuarto con temperatura, iluminación
y humedad relativa controladas; estanterías con iluminación. (Roca, W. M,
Mroginski 1982)
VI. MATERIALES Y MÉTODOS.
6.1 Organización
de los estudiantes en grupo
Para entrar al laboratorio
fue necesario hacer equipos organizados de alumnos, con la finalidad de
realizar una práctica al 100% satisfactoria, ya que al trabajar en colectivo,
los conocimientos son enriquecidos por cada uno de los integrantes.
6.2 Recorrido y
descripción de las áreas del laboratorio y sus equipos respectivos
Mediante la
observación visual se reconocieron las áreas que comprende el laboratorio de
tejidos de cultivo, así como el equipo y material con el que cuenta cada una de
ellas, para ello fue necesario hacer uso de un bolígrafo, una libreta de
apuntes, contemplando en ésta cada una de las áreas apreciadas, con la
finalidad de obtener información más detallada se hizo uso de una cámara
fotográfica con la cual se obtuvieron imágenes representativas de cada uno de
los sitios visitados.
Además del
reconocimiento y material de cada área, se discutió sobre la función de cada
una de ellas, así como la manera de darle un buen uso a éstas.
6.2.1 Áreas de
preparación de medios de cultivos
Para la
preparación de los medios de cultivo se lleva a cabo en una mesa, la cual se
esteriliza utilizando agua y jabón para lavarla, posteriormente se desinfecta
con alcohol. Se cuenta con anaqueles para colocar los materiales de vidrio y de
plástico, en los cuales se encontraran probetas graduadas, pipetas, vasos de
precipitado, agitadores, termómetros, pinzas, matraz erlenmeyer, embudo de
separación, cajas de petri, vidrio de reloj, etc.
Así mismo existe
un área donde se puede encontrar los reactivos y sustancias químicas, dicha
área se encuentra protegida y en condiciones optimas para su conservación. Como
todo laboratorio se cuenta con refrigeradores donde se guardan sustancias y
muestras que requieren de refrigeración.
6.2.2 Área de
lavado y esterilización
El laboratorio
cuenta con lavaderos con agua a temperatura ambiente, éstos tienen tubería y
drenaje, son de metal y se encuentran en condiciones favorables. Al no contar
con una instalación con agua esterilizada, en el laboratorio se hace el agua
esterilizada o por su defecto se compra. Se cuenta con una estufa pequeña para
esterilizar algunos materiales, los depósitos de la basura no son del todo
adecuados para el laboratorio.
6.2.3 Área de
transferencia y siembra
Actualmente
presenta dos cámaras de flujo laminar para llevarse a cabo la siembra, pero
solo una de ellas es la que se encuentra en mejores condiciones, por tal motivo
se requiere de un buen cuidado y manejo.
6.2.4 Área de
incubación
Esta es una de
las áreas primordiales en el laboratorio de cultivo de tejidos, sin embargo no
existe como tal, por esta razón ésta se adecuará para tal función.
VII. RESULTADOS Y DISCUSION
7.1 Áreas del laboratorio
Todo laboratorio sea cual sea su especialización (de
microbiología, de análisis, químico, etc.), se encuentra estructurado en áreas,
las cuales tienen funciones específicas; el laboratorio de cultivo de tejidos
del tecnológico de Cd. Altamirano no es la excepción aunque este no presenta
las áreas marcadas, se pueden adecuar, tal es el caso del área de incubación.
El laboratorio de cultivo de tejidos del tecnológico presenta
las siguientes áreas:
AREA DE PREPARACIÓN
FUNCIÓN: aquí se realiza la preparación de los medios de
cultivo.
MATERIAL:
o
Materiales de vidrio: vasos
de precipitado, frascos, matraz elermeyer (125, 250 y 500 ml)
o
Material de plástico:
probeta graduada
o
Reactivos
EQUIPO: balanza analítica, medidor de pH, platos calientes con
agitación, refrigerador, incubadora, cámara de crecimiento, potenciómetro,
plancha eléctrica con agitador magnético.
AREA DE LAVADO Y DE ESTERILIZACIÓN
FUNCIÓN: en este espacio se realiza el lavado y la
esterilización del material a utilizar para la preparación de los medios de
cultivo.
MATERIAL PARA EL AREA DE LAVADO: Lavadero, agua caliente, agua
fría y agua destilada, basurero para el material vegetal, inorgánico y de
vidrio que se desechen, gradillas para el secado.
En esta misma área se encuentra el refrigerador, ya que esta
alberga material de microbiología, biología
MATERIAL PARA EL AREA DE ESTERILIZACION: Autoclave (olla de
presión), estufa, lavadero, destilador de vidrio
AREA DE TRANSFERENCIA
FUNCIÓN: en esta área se realiza el trabajo de excisión,
inoculación y transferencia del material vegetal (explantes) a los medios de
cultivo.
MATERIAL: tubos de ensayo de boca angosta, navaja o bisturí,
mesas, instrumentos de disección, frascos con alcohol, máscaras, mechero de
alcohol, bandejas, guantes, marcadores de aceite, bote de basura.
EQUIPO: gabinetes de flujo laminar, microscopio.
AREA DE INCUBACION
FUNCIÓN: en esta parte del laboratorio se realiza la incubación,
es importante que se encuentre a temperatura constante
MATERIAL: gradillas para tubos
EQUIPO: cámara de crecimiento, estanterías metálicas o de madera
para colocar los cultivos, aire acondicionado
Es importante recalcar que el laboratorio no cuenta con esta
área como tal, pero ésta se adecuará para tal función.
AREA DE OBSERVACIÓN Y EXAMEN
FUNCIÓN: en esta área se lleva a cabo el análisis periódico de
los cultivos realizados
EQUIPO: microscopio, estereoscopio.
Las áreas que se muestran a continuación no las presenta el
laboratorio, pero son vitales en un laboratorio de cultivo de tejidos.
AREA DE CRECIMIENTO
FUNCIÓN: una vez que los cultivos pasaron al área de incubación,
las plantas son trasplantadas en un recipiente; posteriormente son llevadas a
un sitio propiamente acondicionado y cubierto en el techo con una maya.
MATERIAL: macetas, suelo, bandejas.
EQUIPO: aire acondicionado, cámaras húmedas de plástico
AREA DE CUARENTENA Y CONTROL FITOSANITARIO
FUNCIÓN: esta es el área de recepción de las muestras o plantas
contaminadas (virus, bacterias, hongos) destinadas a la limpieza clonal; para
ello se encuentra protegida de insectos; cabe mencionar que es un espacio
separado del laboratorio para evitar la infestación de otras muestras.
7.2 Organización de los reactivos
El laboratorio además presenta un área donde se almacenan los
reactivos y sustancias como las sales para la preparación de los medio de
cultivo, los cuales se concentran en un estante; las sales se pueden
identificar por su tapadera azul y el nombre de J. T. Baker.
7.3 Normas de comportamiento
Las normas de
seguridad de los laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas
a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios
derivados de la actividad, con el fin de evitar accidentes y contaminaciones
tanto dentro de su ámbito de trabajo como hacia el exterior.
Las reglas básicas
que se establecen en un laboratorio son un conjunto de prácticas de sentido
común que se deben realizar en forma rutinaria al ingresar a este.
El elemento clave es
la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer
y combatir los riesgos presentes en el laboratorio.
- Es importante reconocer los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: extintores, salidas de emergencia, lavaojos.
- El laboratorio cuenta con un botiquín de primeros auxilios en caso de ser necesario.
- No se permite ingresar alimentos ni bebidas.
- Se bebe introducir al laboratorio con la vestimenta apropiada: bata, zapatos cerrados, cabello recogido, guantes, cubre boca
- Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada equipo es responsable directa de la zona que le ha sido asignada.
- Las manos deben lavarse después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
- No se permite correr dentro del laboratorio
- Es importante cubrirse la cara de salpicaduras; para ello se debe utilizar anteojos de seguridad y cubre bocas.
- Se debe hacer uso adecuado del material toxico y flameable
Así que es importante que como alumnos tomemos las medidas de
seguridad correspondientes para evitar algún percance, siempre atendiendo a las
reglas establecidas en el laboratorio.
VIII.CONCLUSION
Es importante que cada laboratorio cuente con las áreas y el
material adecuado para realizar los procesos, técnicas y procedimientos de una
manera veraz y precisa, con la finalidad de obtener en cada una de las
prácticas resultados satisfactorios.
Por otro lado es necesario conocer y poner en práctica cada una
de las reglas o normas creadas en el laboratorio, puesto que estas se
establecieron con la finalidad de prevenir accidentes en caso de hacer mal uso
de las instalaciones, equipos y sustancias que existen en él, así mismo poner
en práctica los valores entre los alumnos que hacen uso de esta estancia.
Aunque el
laboratorio del tecnológico no cuenta al 100% con las instalaciones o áreas
requeridas para el cultivo de tejidos, se aprovecha al máximo las aéreas y el
equipo con el que se cuenta.
IX.
FUENTES CONSULTADAS
Ø
Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John
Innes Symposium the Plant Genoma and Second.
Ø
Roca & Mroginski. (1982). Experimentes in Plant Tissue Culture. Cambridge University
Press.
Ø
Dixon, R.A. (1986). Plant Cell Culture A Practical Aproch, I. R. L.,
Press Washington D.C.
Ø
Evans, D.A. ET, al. (1983). Handbbook of Plant Cell Culture Vol.I, II,
III y IV. McMillan Publishing Co. New York.
Ø
Helgeson, J.P. and B.J. Deveral (1983). Use of Tissue Culture and
Protoplast in Plant Pathology. Academic Press. New York.
Ø Clifton, E Meloan (1973). Problemas y Experimentos en Análisis
Instrumental. Editorial Reverte Mexicana, S. A. 1973. México
Ø Flaschka, h. a (1980). Química Analítica Cuantitativa Vol. II. Compañía
Editorial Continental S.A. México.
Ø Garzón g. Guillermo (1989). “Fundamentos de Química General” serie Skgaum
segunda edición.
Ø Homer, D. Chapman (1979). Métodos de Análisis para suelos, plantas y aguas.
Editorial Trillas. México.
Ø Reina T. Merlín (2003). Análisis Químico
Cuantitativo. Editorial Porrua. Saunders, L. Fisicoquímica para estudiantes de
biología, farmacia y medicina
Ø Dodds J.H., Roberts L.W.,
1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge
University Press, 122-132.
Ø Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales.
Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medellín. Facultad de Ciencias
Agropecuarias. Departamento de Agronomía.
Ø Murashige T., Skoog F.,
1962, A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee
cultures, Physiol. Plant., 15:473-97
Ø Pierik R.L.M., 1990, Cultivo
in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid. www.scribd.com/.../hvRLSAS-RAI-LABORATORIO-DE-CULTIVO-..
02:30 18/02/12
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